پروتوپلاست سلولی است که دیواره آن به طور کامل حذف شده است . امتزاج پروتوپلاست عبارت است از اخطلاط پروتوپلاست های گیاهی ( سلول های عاری از دیواره سلولی ) از سلول های سوماتیکی گونه های متفاوت و تجدید نسل گیاهان هیبرید حاصل از پروتوپلاست های مخلوط شده می باشد .
اولین تلاش موفقیت آمیز در امتزاج پروتوپلاست گل اطلسی توسط پاور و همکارانش ( Power . ۱۹۷۶ ) در انگلیس و نیز کارلسون و همکارانش ( Carlson . ۱۹۷۵ ) در آمریکا در تنباکو بود . بعد از جداسازی پروتوپلاست تنها مانع بین سیتوپلاسم و محیط خارجی غشاء پلاسما می باشد . فقدان دیواره سلولی باعث برقرار شدن تماس نزدیک غشاء پلاسمایی دو یا چند پروتوپلاست می شود که این امکان تحت شرایط طبیعی وجود ندارد وقتی غشاء پلاسمایی دو پروتوپلاست با هم تماس می یابند ، تحت بعضی شرایط آنها همانند دو حباب صابون به همدیگر خواهند چسبید . بعدا ً اگر محرک مناسبی بر روی آنها اعمال شود بار دیگر مثل دو حباب صابون با یکدیگر امتزاج یافته و به صورت یک گوی احاطه شده با یک غشاء درمی آیند . امروزه توجه زیادی برای امتزاج پروتوپلاست به عنوان یک وسیله بهنژادی گیاهان صورت می گیرد . اگرچه نتایج مثبت در این زمینه جهت تولید گیاهان زراعی اصلاح شده خیلی نادراست ولی اشخاص زیادی امتزاج پروتوپلاست را یک وسیله مفید برای اصلاح گران می دانند که آنها می توانند با استفاده ازاین روش گونه های ناسازگار جنسی را باهم تلاقی داده و صفات هسته ای و سیتوپلاسمی را منتقل نمایند . امتزاج پروتوپلاست را می توان برای تلاقی درون گونه ای ، درون جنسی و بین جنسی به کار برد . امتزاج پروتوپلاست ابزاری در جهت نیل به توارث فراجنسی ژنوم های اندامکی هر دو والد به شمار می رود . در فراورده های الحاقی که هسته ها ، پلاست ها و میتوکندری های هر دو والد در یک سلول حضور دارند ، اجتماع تازه ای از هسته یک گونه و اندامک های یک گونه دور پدید می آید . از طرفی نیز اثرات متقابل در سطح DNA بین ژنوم های اندامکی موجبات خلق ژنوم های مورد علاقه در اصلاح نباتات می شود . امتزاج پروتوپلاست و دوروگ گیری سوماتیکی در جنس ها و گونه هایی انجام می شود که تلاقی پذیری ندارد . این کار به منظور دست کاری گونه های گیاهی و در جهت افزایش تنوع ژنتیکی و ایجاد صفات و یا گیاهان جدید و تولید سیبریدها ( دورگ های سیتوپلاسمی ) استفاده می شود . با توجه به اینکه امتزاج پروتوپلاست برای آمیزش گونه هایی که نمی توان به صورت جنسی تلاقی یابند استفاده می شود ، لذا امتزاج پروتوپلاست را دورگ گیری شبه جنسی ( parasexual hybridization ) نیز نام گذاری کرده اند ، این فنون با رفع محدودیت تلاقی های بین گونه ای و بین جنسی از طریق کشت تخمک نارس یا بالغ ( Invitrro pollination ) و با بکارگیری فنون نجات ( یا کشت ) جنین ( embrio rescue ) به عنوان مکمل روش های اصلاح سنتی عمل نمایند . پومیتو ( Pomato ) تنها گیاه جدیدی است که از طریق امتزاج پروتوپلاست گوجه فرنگی و سیب زمینی تولید شده است ولی هنوز بهره برداری کشاورزی ندارد . امتزاج پروتوپلاست و تبادل سیتوپلاسم ها
در صورتیکه هدف ادغام هسته یک والد با سیتوپلاسم کامل والد دیگر است و درصورتیکه فراوانی دورگ های هسته ای بالا باشد می توان سیتوپلاسم بخشنده را به وسیله اشعه ایکس یا گاما در زمان قبل از امتزاج پرتو تابی کرد . این تیمارهیچ گونه اثر زیان آور بر روی ژنوم اندامک های نتایجی که پروتوپلاست آنها تابش دیده ندارد ، زیرا ژنوم ها تکرار زیادی دارند . برای اینکه صرفا ً اندامک های سیتوپلاسمی والدپرتو دیده نگهداری شود . مجیسی و همکاران ( ۱۹۸۰ ) برای حذف اندامک های والد دیگر ، استفاده از روش بازدارندگی متابولیکی که برای اولین بار در ژنتیک سلولی پستانداران مطرح شد پیشنهاد کردند ( Medgyesy ، ۱۹۸۰ ) . موادی مانند استات ید و استامیدید که بدین منظور و در این روش استفاده می شود ، پرتوتابی سیتوپلاسم والد بخشنده و عدم فعالیت متابولیکی هسته ای والد گیرنده را در هم ادغام می کند ( روش بخشنده - گیرنده ) و در حال حاضر به طور معمول استفاده می شود .
امتزاج پروتوپلاست و نوترکیبی ژنوم های پلاست
تفرق تصادفی تیپ های والدی در نسل های متوالی سلولی ، فراوانترین الگوی رفتاری توده مخلوط پلاست ها در یک فرآورده امتزاج به شمار می رود . اینگونه موارد در گزارش های متعدد هیبریدهای رویشی ( با هسته های هیبرید ) و هیبریدهای سیتوپلاسمی ( سایبریدها ) به تایید رسیده است . تحقیقات انجام شده حاکی از وقوع نوترکیب ژنوم پلاست در گیاهان عالی پس از دورگ گیری رویشی است ( بین N.plumbaginifolia و N.tabacum ) . در هر دو مورد ، از جهش یافته های پلاست که مشخصه آنها مقاومت به آنتی بیوتیک یا توکسین و آلبینیسم می باشد استفاده شده است . کمبود نوترکیبی پلاستی مانع انجام هرگونه تخمین دقیق از فراوانی این نوترکیبی ها در سلول های هتروپلاست حاصل از الحاق می شود . معلوم شده است کلید این موفقیت ها که استفاده از فشار گزینشی شدید بوده فقط زمانی امکان دارد که پلاست های جهش یافته به کار گرفته شوند . تجزیه و تحلیل مولکولی ژنوم های پلاست به دست آمده در نوترکیب های نیکوتیانا نشان داده است که از تعداد زیادی کراسینگ اور ناشی شده اند .
امتزاج پروتوپلاست و نو ترکیبی ژنوم های میتوکندریابی
نر عقیمی سیتوپلاسمی که در طیف وسیعی از گونه ها پیدا می شود تنها نشانگر ژنتیکی است که توسط ژنوم میتوکندری هدایت می شود . از این پدیده برای پیگیری سرنوشت ژنوم های میتوکندری در امتزاج پروتوپلاست استفاده می کنند . فقدان فشار گزینشی در سطح سلولی مانعی در سر راه بدست آوردن نوترکیبهای میتوکندریابی محسوب نمی شود . وقوع نوترکیبی معمولاً با یک فراوانی بالا رخ می دهد . مطالعات مولکولی قطعات محدود شده جدید میتوکندریابی در هیبریدهای رویشی یا سایبریدهای اطلسی و براسیکا تبادل DNA والدین را به خوبی به اثبات رسانده است . در نتیجه ژنوم میتوکندریابی با ترکیبی جدید نوترکیبی جدید و ترکیبی منحصر به فرد از توالی های والدی درهر سایبرید باززایی شده است . مطالعات امتزاج ، گیاهان نر عقیم سیتوپلاسمی را نیز شامل می شود . فنوتیپ سیتوپلاسمی در طول در طول مرحله گلدهی مشخص می گردد . در نیکوتیانا ، نرعقیمی ها بوسیله سیتوپلاسم گونه های مختلف القاء می شود . در این ترکیبات آلوپلاسمی ، پرچم ها به طور کلی حذف و یا اینکه به ساختارهای شبه ماده و یا گلبرگ مانند تغییر می یابند . هر سیتوپلاسمی را می توان از طریق ظاهر خاص گل شناسایی کرد . جنبه جالب توجه نوترکیبی میتوکندریابی حاصل از نیکوتیانای طبیعی و عقیم ، پیدایش ظواهری جدید در گلی است که با هر دو والد متفاوت است . این گونه نوترکیبات که در بین ژنوم های میتوکندریابی را در بین گونه ها نوید می دهد .
کاربرد امتزاج رویشی در دست ورزی گونه های زراعی
ژنوم های پلاستی که با یکدیگر در یک سلول منفرد ادغام می شوند . در مواقعی که یکی از والدین فاقد رقابت و یا از رقابت کمتری در مقایسه با دیگری برخوردار است این امر خیلی سریعتر به وقوع می پیوندد . بالعکس ، ژنوم های میتوکندریابی نوترکیب همراه با ژنوم پلاست یکی از والدین را دارا هستند .
انتقال سیتوپلاسم های نر عقیم به ارقام مختلف
امتزاج پروتوپلاست ابزاری برای انتقال تک مرحله ای یک سیتوپلاسم نر عقیم به واریته های مختلف بارور است . بدین ترتیب چرخه های متعدد تلاقی برگشتی مورد نیاز در روش های معمول تلاقی جنسی منتفی می گردد . در برنج گیاهان سایبرید حاوی هسته واریته بارور و میتوکندری های نوترکیب هر دو والد ، نر عقیمی والد نر عقیم را با خود حفظ کرده است .
این موفقیت بر اساس روش بخشنده - گیرنده صورت گرفته است ( Sidorov ، ۱۹۸۱ ) در هویج نیز بر مبنای همین روش ، نرعقیمی سیتوپلاسمی ( بساک قهوه ای ) به یک رقم بارور منتقل شده است . در براسیکا ، به ارقام مختلف منداب روغنی ، نر عقیمی سیتوپلاسمی انتقال یافته است . همچنین یک سیتوپلاسم سایبرید نرم عقیم اصلاح شده را که قبلاً از طریق دو رگ گیری رویشی به دست آمده بود به منداب روغنی زمستانه انتقال داده اند . در چغندرقند باززایی گیاه کامل از پروتوپلاست ها ، امکان انتقال سیتوپلاسم از منابع مختلف نر عقیم سیتوپلاسمی را به زمینه های مختلف هسته ای فراهم ساخته است . این روش در گونه مذکور از اهمیت خاصی برخوردار است زیرا چغندرقند دو ساله بوده و تولید هیبرید در جهان صرفاً بر مبنای نر عقیمی اون ( Owen CMS source ) (۱۹۴۵) است به طوری که این محصول به طور بالقوه در برابر نژادهای جدید پاتوژن ها آسیب پذیر می گردد . در توتون بر مبنای ادغام پروتوپلاست N.plumbaginifolia با N .tabacum ( حاوی پروتوپلاست پرتو دیده ) تیپ جدیدی از نر عقیمی سیتوپلاسمی خلق شده است . ترکیب مذکور به خصوص در موقعی که گونه دوم به عنوان والد مادری در نظر گرفته می شود به طور جنسی ناسازگار است .
اصلاح سیستم های نر عقیمی سیتوپلاسمی در چلیپاییان
دارند ، ( B.napus,... ) و روغن ( B.oleracea ,... ) محصولات کلمیان اهمیت اقتصادی مهمی از نظر سبزی برای مصارف انسانی و صنعتی پس از سویا و نخل سومین منبع مهم روغن به شمار می روند . با اینکه واریته های هیبرید در این گونه ها بر مبنای سیستم های خود ناسازگاری تولید شده اند . نر عقیمی سیتوپلاسمی پیدا شده در تربچه به براسیکا اولراسیا و براسیکا ناپوس از طریق تلاقی بین گونه ای منتقل گردید ولی گیاهان حاصله ضمن اینکه به طور کامل نر عقیم بودند به خاطر نقص کلروفیلی در دماهای پایین و ناهنجاری های گل ( تولید ناقص شهد و کاهش باروری ماده ) عملا ً قابل استفاده نبودند . در بررسی پلتیرو همکاران به منظور تبادل کلروپلاست های تربچه با کلروپلاست های براسیکاونیل به سنتز طبیعی کلروفیل ، امتزاج رویشی بین پروپلاست های براسیکای حاوی اندامک های تربچه و پروتوپلاست های دارای اندامک های براسیکا صورت گرفت و از بین گیاهان باززایی شده گیاهان سبز طبیعی و نر عقیم جدا شدند ( Pelletier ، ۱۹۸۳ ) آنها نشان دادند که حاوی ژنوم های نو ترکیب میتوکندریابی هستند . در بین این سایبریدها ، بعضی توسط متخصصین انتخاب شدند ، زیرا در آزمایش های مزرعه با نتاجشان ثابت کردند که سایر نقایص مربوط به مرفولوژی گل در آنها رفع شده است .
تولید شهد در این گیاه آنقدر کافی بود که همانند گیاه بارور زنبورها را جلب و تشکیل بذر طبیعی گشت . این ویژگی ها با وقایع نوترکیبی بین ژنوم های میتوکندریابی دو والد همبستگی داشت . بر اساس نتایج بدست آمده از سایبرید های براسیکا این نکته به اثبات رسید که از جنبه اصلاحی فقط بایستی بخش کوچکی از ژنوم بیگانه به درون گونه زراعی وارد گردد . زمانی که یک ژنوم صفت مطلوبی مانند نر عقیمی سیتوپلاسمی را با خود دارد و ژنوم کامل اندامک منتقل می گردد . به خاطر اثر متقابل بقیه ژن ها با هسته گونه زراعی ، معایب زراعی احتمال ظهورشان بالاست . این نتایج اهمیت عملی نوترکیبی میتوکندریابی که مجال حذف این صفات نامطلوب را فراهم می کند به اثبات می رساند . از این سیتوپلاسم ها در حال حاضر توسط متخصصین اصلاح نباتات استفاده میشود .
هیبریداسیون سلول سوماتیکی
هیبریداسیون سلول سوماتیکی که لقاح سلول سوماتیکی یا لقاح پروتوپلاست نامیده می شود دلالت بر اتحاد پروتوپلاست گیاهی سلول های سوماتیک گونه های مختلف و متعاقباً باززایی گیاهان هیبرید حاصل از پروتوپلاست های لقاح شده دارد . این روش برای استفاده در به نژادی گیاهی برای ایجاد هیبرید با اتحاد سلول های سوماتیک که در آن گیاه به طریقه دو رگ گیری جنسی تلاقی های بین گونه ای تهیه بذر امکان پذیر نباشد ، توصیه شده است . هیبریداسیون سلول سوماتیکی فرآیندی چند مرحله ای شامل ایزوله نمودن پروتوپلاست های گونه های مختلف ، امتزاج پروتوپلاست های دو گونه مختلف ، شناسایی نمودن پروتوپلاست های لقاح یافته هیبرید و باززایی گیاهان هیبرید دور از پروتوپلاست های لقاح شده می شود . قبل از اتحاد سلول های گیاهی ، حذف دیواره سلولی جهت تولید پروتوپلاست های بدون دیواره ضروری است . سلول های مزوفیل برگ یا سایر بافت های گیاهی ، کالوس یا کشت های سوسپانسون سلولی با آنزیم های هضم کننده دیواره سلولی برای بدست آوردن سوسپانسیون پروتوپلاست ها ، تیمار می گردند . برای دو رگ نمودن پروتوپلاست های خالص گونه ها آنها را مخلوط نموده و به همراه یک عامل آمیخته کننده غالباً پلی اتیلن گلایکول سانتریفوژ می نمایند . تا آنجا مخلوطی از پروتوپلاست های والدی ، پروتوپلاست های آمیخته شده هیبرید بوجود می آید . پروتوپلاست های هیبرید به سلول های دارای دیواره و ادامه تقسیم سلولس وادار شده و در نهایت گیاهچه های دارای ریشه و ساقه تولید می گردند . هیبریداسیون سلول سوماتیکی هنگامی به عنوان روشی برای اصلاح کننده نبات مورد استفاده می باشد که تکنیک های متداولی برای کشت پروتوپلاست گونه والدین ایجاد گردد .
باززایی گیاه از پروتوپلاست های بعضی از گونه ها مثل سیب زمینی ، توتون ، یونجه و تعداد اندکی از گونه های دیگر به راحتی امکان پذیر است در حالی که در غلات و حبوبات به سختی قابل اجرا می باشد . سلول های بین گونه های خویشاوند دور اغلب آنیوپلوئید بوده و به ندرت باززایی شده و در صورت باززایی شدن گیاهانی عقیم بدست می آید .
روش های القاء امتزاج :
امتزاج خود بخودی
همانطور که از اسم این روش مشخص است روشی است که در آن امتزاج پروتوپلاستی بدون دخالت دادن هر نوع ماده امتزاج دهنده یا استفاده از محرک صورت می گیرد . امتزاج خود بخودی برای اولین بارتوسط کاستر در سال ۱۹۰۲ تشریح شد . عیب عمده این روش این است که امتزاج به ندرت اتفاق می افتد . به کاربردن امتزاج خود بخودی تولید پروتوپلاست های چند هسته ای در سویا را که هسته های آنها به طور همزمان تقسیم می شوند امکان پذیر ساخته است . فراوانی اندک امتزاج با این روش مانع از توسعه آن گردیده و لذا تاکید بیشتر بر روش های آزمایشی امتزاج که ذیلاً تشریح می شود صورت می گیرد .
روش القاء امتزاج با پلی اتیلن گلیکول ( PEG )
روش استفاده از پلی اتیلن گلیکول به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج ، برای اولین بار توسط کائو در میکالوگ و والین و همکاران (۱۹۷۴) تشریح شده است .
PEG یک پلیمر آلی است که با وزن های مولکولی متفاوت قابل دسترس می باشد . موثرترین دامنه ۱۵۴۰ PEG ، ۴۰۰۰ PEG و ۶۰۰۰ PEG می باشد . برای القاء امتراج با PEG آن را به محیط کشت اضافه می نمایند و در این ماده مخلوط پروتوپلاست های قابل امتزاج را به حالت سوسپانسیون در می آورند . معمولا ً از PEG ۳۳- ۲۵ درصد ( حجمی / وزنی ) استفاده می شود . باید دقت کرد از مقدار درست و اندازه و اندازه مولکولی صحیح PEG استفاده کرد . افزودن مقدار زیادی از این ماده باعث انعقاد توده های پروتوپلاست می گردد و اضافه کردن مقدار خیلی کم آن موجب چسبیدن پروتوپلاست ها به جای امتزاج می شود . کار با PEG بایستی به دقت مورد ارزیابی قرار گیرد ، زیرا این ماده در سلول ها باعث مسمومیت می گردد . به طور معمول ، مخلوط پروتوپلاست را با PEG به مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه در انکاباتور قرار می دهند . بعد از این مدت PEG را می شویند تا از مخلوط حذف گردد . اکثر امتزاج ها در مرحله شستشو قرار می گیرد .
بکار بردن PEG به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج امروزه بطور وسیع مورد استفاده قرار می گیرد .
روش استفاده از کلسیم و PH بالا
این روش شامل قرار دادن مخلوط پروتوپلاست در ۵./. مول کلروکلسیم با PH برابر ۵/۱۰ در ۴/. مول مانیتول درون انکوباتور می باشد ( Keller and Melchers ۱۹۷۳ ) پروتوپلاست ها را بعد از آن به مدت ۳ دقیقه در سرعت پایین سانتریفوژ ( g ×۵۰ ) در درون مخلوط قرار می دهند . کلروملچر موفقیت درامتزاج ۲۵ درصد پروتوپلاست ها را گزارش کرده اند . این روش برای امتزاج پروتوپلاست های مزوفیل برگ و پروتوپلاست های بدست آمده از سلول های کشت شده مورد استفاده قرار گرفت . پروتوپلاست های امتزاج یافته با مشاهدات چشمی قابل تشخیص هستند .
استفاده از نیتریت سدیم
اضافه کردن نیتریت سدیم ( No Na۵ ) به مخلوط پروتوپلاست ها به امتزاج آنها کمک می کند . استفاده از این روش توسط پارو و همکاران ( ۱۹۷۰ ) در موقع امتزاج درون گونه ای و بین گونه ای در پروتوپلاستهای یولاف و ذرت توسعه یافت . نیتریت سدیم امتزاج بین پروتوپلاست های با سیتوپلاسم زیاد ، پروتوپلاست های با واکوئل کم و پروتوپلاست های ریشه را القاء می کند . به طوری که هر چه پروتوپلاست ها متمایزتر باشند به همان میزان القاء امتزاج آسان تر خواهد شد .
روش های مصون سازی
هارتمن و همکاران ( ۱۹۷۳ ) روش مصون سازی القاء امتزاج پروتوپلاست را تشریح کردند . آنها پادتنی را با تزریق عصاره های گیاهی به بدن خرگوش تولید کردند . خرگوش دامنه وسیعی از آنتی بادی را بر ضد پروتئین های مختلف گیاهی تولید کرد . سپس اثر این پادتن را در امتزاج پروتوپلاست های به دست آمده از Bromus ، سویا و باقلا مورد مطالعه قرار دادند . این پادتن پس از امتزاج پروتوپلاست ها باعث آخته شدن گردید . پروتوپلاست های امتزاج یافته قوه نامیه خود را حفظ کرده و حتی تقسیمات سلولی هم در آنها مشاهده گردید .
امتزاج مکانیکی
میشل و اسچریک ( ۱۹۷۱ ) از روش های فیزیکی نظیر فشارهای مکانیکی القاء امتزاج پروتوپلاست استفاده می کردند . این روش ها به لحاظ راندمان کم آنها در تولید دورگ ها کمتر مورد توجه قرار گرفتند . ولی یکی از محاسن این روش این است که هیچ ماده شیمیایی که ممکن است عوارض جانبی داشته باشد ، مثل ایجاد موتاسیون در سلول های کشت شده ، در اینجا به کار نمی رود .
امتزاج الکتریکی
اگر پروتوپلاست را در یک محیط کشت سلولی حاوی الکترود قرار دهند و به آنها انرژی های پتانسیل مختلف وارد نمایند پروتوپلاست ها بین دو الکترود در یک خط قرار می گیرند . ( Zimmer , man ۱۹۸۲ ) . اگر شخص در این موقع شوک های الکتریکی با موج های مربعی کوتاه وارد نماید می تواند القاء پروتوپلاست را فراهم سازند . این روش به خاطر قابلیت کنترل بالای ذاتی از معروفیت زیادی برخوردار است . در حقیقت امتزاج دو پروتوپلاست با این روش امکان پذیر است .
روش های دیگر
کامیا ( Kameya ) استفاده از ژلاتین با غلظت ۲ تا ۵ درصد را به یک ماده امتزاج دهنده گزارش نموده است . او همچنین نشان داده است که ( PotassiumDextranSulphate ) ماده امتزاج دهنده خوبی است . از مواد شیمیایی دیگر که به عنوان مواد امتزاج دهنده با درجات مختلف استفاده شده است . کانکانوالین آ ( AConcanvalin ) پلی - ال - ارنیتین ، سیتوچلازین بی ، پلی - ال - لایزین ، گلیسرول و دی متیل سولفوکسید را می توان نام برد . ظاهراً روش های مختلف و زیادی برای القاء پروتوپلاست موجود است . در اکثریت این روش ها ، دو نوع پروتوپلاست با منشا مختلف در حضور ماده امتزاج دهنده با هم مخلوط می کنند و اجازه می دهند آنها به طور تصادفی با هم امتزاج یابند . مشکل این روش این است که پروتوپلاست نه تنها با سلول های هم نوع خود امتزاج می یابد بلکه با انواع دیگر هم می تواند ترکیب شود . روش هایی جهت شناسایی امتزاج های مطلوب که بطور طبیعی از امتزاج پروتوپلاست های نوع A با پروتوپلاست های نوع B حاصل می شود وجود دارد . در زیر به چند روش که برای غربالگری دورگ های سماتیکی استفاده شده است اشاره می کنیم .
الف - غربالگری مشاهده ای : از این روش برای غربالکری گیاهان حاصل از پروتوپلاست هایی که دارای صفات فیزیکی مشخصی هستند استفاده می شود . نتیجه این امتزاج تولید دورگی است که دارای واکوئل های حاوی کلروپلاست و آنتوسیانین با دو هسته می باشد . همچنین این روش می تواند برای امتزاج پروتوپلاست های بدست آمده از مزوفیل برگ و پروتوپلاست های سلول های کشت شده فاقد کلروفیل نیز مورد استفاده قرار گیرند . تکنیک ارزیابی مشاهده ای گاهی با روش کشت قطرات ریز ( Microdrop ) با هم به کار برده می شود . این قطرات ریز به طریق میکروسکوپی مورد آزمایش قرار گرفته است ، آن قطراتی که در آنها امتزاج انجام شده است نشان دار می کنند تا نمود بعدی آن را دنبال کنند . عیب عمده این روش آن است که خیلی پر زحمت بوده و تعداد محدودی از محصول امتزاج یافته را می توان غربالگری کرد .
ب - نشان های فلورسانس : استفاده از روش های رنگی فلورسنت برای اولین بار توسط کلر ( ۱۹۷۷ ) برای مطالعه امتزاج در سلول های گیاهی تشریح گردید . بعد ها از این روش برای امتزاج پروتوپلاست گیاهی جدا شده قابل استفاده شد . این روش بر این پایه برنامه ریزی شده است که اگر از دو پروتوپلاست اصلی کشت شده یکی را در sceininofluorece Octadecony و دیگری را در Palamine B Octadecy به مدت ۱۲ تا ۱۵ ساعت درون انکوباتور قرار دهند ، هر گروه از این پروتوپلاست ها توسط یک رنگ ویژه فلورسانس رنگ آمیزی خواهند شد . این مواد رنگی برای پروتوپلاست ها ایجاد مسمومیت نکرده و صدمه ای به قوه نامیه ، بازآفرینی دیواره و رشدشان وارد نمی سازند . پس از ایجاد امتزاج و تولید محصول امتزاج یافته ، شناسایی این دو رگ ها با مشخصات فلورسانس مربوطه زیر میکروسکوپ فلورسانس امکان پذیر خواهد بود و با استفاده از یک میکرومانیپولار هنوز یک روش وقت گیر بوده و نیاز به مهارت دارد .
ج - استفاده از دستگاه غربالگر سلولی فعال شده با فلورسانس : پروتوپلاست را با فلورسانس نشان دار می کنند که در بخش ( ب ) بیان گردید . پس از امتزاج سه نوع فلورسانس می توان مشاهده کرد : دو نوع از آنها فلورسانس های اصلی از جمعیت والدین می باشند و نوع سوم فلورسانس دورگ های حاصل از امتزاج است . این روش هنوز در مرحله آزمایشی است ولی با این روش می توان هزاران محصول امتزاج را جدا نمود . عیب عمده این تکنیک ظاهر فریبی و هزینه آن می باشد .
چ - غربالگری با توجه به مواد غذایی : در حالت های ویژه ، کارلسون و همکاران توانستند محصول دو رگ ( امتزاج یافته ) را با امکان کشت آنها در روی ماده غذایی که در آن امکان رشد برای لاین های والدین پروتوپلاست وجود ندارد جدا نمایند . کارلسون توانست پروتوپلاست های والدین و محصول امتزاج یافته را در محیط کشت فاقد اکسین کشت نماید . در این محیط دو لاین سلولی مربوط به والدین به خاطر فقدان اکسین در محیط کشت نتوانستند رشد کنند . ولی سلول های دو رگ تولید کننده اکسین توانستند رشد کرده و به کالوس تبدیل شوند . کارلسون توانست این گیاهان دورگه سوماتیکی را با گیاهان تولید شده با تلاقی جنسی متداول مقایسه نماید .
ح - حساسیت به نور : ملچرولبیب ( ۱۹۷۴ ) یک روش برای غربالگری دو رگ ها بر اساس مکمل ژنتیکی تشریح نمودند . آنها دو موتانت توتون را یکی با کلروفیل ناقص و دیگری حساس به نور را از توتون ( Tobacum N ) در آزمایش های خود بدست آوردند . وقتی پروتوپلاست های این دو گیاه را با هم امتزاج دادند ، نتیجه دستیابی به یک گیاه سبز نرمال بود . به این جهت در موقع بازآفرینی گیاهچه از مخروط پروتوپلاست دو کلون والدین به نور حساس بودند . ولی گیاهچه دو رگ یک گیاه سبز نرمال بود . این یک روش دقیق برای غربالگری دورگ های سوماتیکی است .
نیاز برای تولید تعداد بیشماری موتاسیون های قابل غربالگری یعنی گیاهچه حساس به نور و دارای کلروفیل ناقص برای این نوع مطالعات زیاد است .
د - حساسیت به دارو و مقاومت : پاور و همکاران ( ۱۹۷۶ ) از حساسیت گیاهان بر اکتینومایسین دی برای غربالگری محصولات امتزاج حاصل از اطلسی nia hybrida , P.parodii استفاده کردند . دو گیاه والدینی به اکتینومایسین - دی حساس ولی گیاه دو رگ مقاوم به آن می باشد . پاور توانست دو رگ های سوماتیکی را در حضور اکتینومایسین - دی در ماده غذایی بازآفرینی نماید . بعضی از محققین حالا به دنبال تولید موتانت های بسیار مقاوم هستند تا در مطالعات امتزاج پروتوپلاست از آنها استفاده شود .
چه گیاهانی را باید دورگ گیری کرد ؟
در اوایل سال ۱۹۶۰ بیولوژیست های گیاهی می خواستند بین علم و افسانه علمی تلاقی انجام دهند و امتزاج پروتوپلاست تا حدودی مطرح شد که بیشتر خیالی بود .
به عنوان مثال می خواستند بین هویج و کلم پیچ دورگ گیری انجام دهند به طوری که در قسمت هوایی تولید کلم و در زیر خاک ریشه هویج بدست آورند . نظیر آرزوی بشر در تولید پومیتو ( Pomato ) ( در قسمت هوایی گوجه فرنگی و در قسمت زیرین سیب زمینی ) دورگ گیری به عنوان یک سیستم مدل برای مطالعه گوجه فرنگی و سیب زمینی موفق بود گرچه این روش دورگ های سوماتیکی را تولید کرده و برای مطالعات پایه مفید است ولی تا بحال گیاه زراعی با ارزش از این روش به دست نیامده است . اخیراً امتزاج پروتوپلاست سیب زمینی های دارای ناسازگار جنسی S.brevidens . S.tuberosum انجام شده است . دورگ های ایجاد شده با روش امتزاج سماتیکی بارور بود و حاوی ژن های مهم مقاومت والد S.brevidens مثلاً مقاومت به ویروس پیچیدگی برگ ( PLRV ) می باشد . این روش با اینکه قابل استفاده است ولی از آن نمی توان مستقیماً برای تولید گیاهان زراعی مفید بهره برداری کرد اما یک وسیله خوب برای وارد کردن ژن ها به داخل برنامه های به نژادی سنتی است .
تشکیل سایبرید ( Cybrid )
وقتی دو پروتوپلاست با هم امتزاج می یابند حالات مختلفی ممکن است حاصل شود اگر دو هسته با هم امتزاج یابند یک دو رگ حقیقی تشکیل می شود . ولی اغلب دو هسته به طور مستقل از هم در سیتوپلاسم مخلوط به دست می آیند و تشکیل هتروکاریون را می دهند . تلفات کروموزومی می تواند در یک یا هر دو هسته ایجاد شود . اگر تمام هسته یکی از والدین از بین برود تنها یک هسته در مخلوط دو سیتوپلاسم باقی می ماند که این دو رگ را سیتوپلاست یا سایبرید می گویند . سایبریدها را همچنین می توان با امتزاج یک پروتوپلاست طبیعی ( نرمال ) با یک پروتوپلاست بدون هسته ( enucleated ) تولید کرد . پروتوپلاست بدون هسته رابا پرتو تابی یا حذف فیزیکی هسته می توان به دست آورد . در تولید طبیعی دورگ از راه تکثیر جنسی دوگامت با هم امتزاج یافته و تولید جنین زیگوت می نمایند . در این فرآیند سیتوپلاسم والد به طور طبیعی خارج شده و تنها صفات سیتوپلاسمی والد مادری باقی می ماند . بنابراین تولید سایبرید یک روش مفید برای انتقال اطلاعات توارثی سیتوپلاسمی می باشد . در حال حاضر محققین در مورد استفاده از سایبریدها برای انتقال قدرت مقاومت در برابر بعضی علف کش ها مطالعه می کنند . این صفت مقاومت در روی ژنوم کلروپلاست حمل می شود . انتقال نر عقیمی سیتوپلاسمی می تواند با انتقال ژن میتوکندری کنترل شود . مطالعه در روی سایبریدها همچنین برای تحقیق در امکان نوترکیبی در ژنوم های برون کروموزومی از اهمیت زیادی برخوردار است .
چشم اندازهای تکنولوژی پروتوپلاست
پیشرفت های قابل توجهی در دو دهه اخیر در تکنولوژی پروتوپلاست ( جدا کردن ، امتزاج ، کشت و باززایی گیاه )
در محصولات مهم زراعی از جمله غلات پدیدار شده است . امتزاج رویشی از طریق تولید هیبریدهای هسته ای نا متقارن بین گونه های دور مجال فائق آمدن بر موانع تبادلات در تکثیر جنسی را فراهم کرده است . در مواردی که پلی پلوئیدی و یا فقدان اندام های جنسی بارور ( محصولاتی که از طریق رویشی تکثیر می شوند ) مانعی بر سر راه تبادلات ژنی است این تکنیک امکانات زیادی را در اختیار قرار می دهد . بعلاوه امتزاج پروتوپلاست ابزار غیرقابل جایگزینی است که موجبات دست ورزی ژنوم اندامک ها را فراهم می کند و خلق ترکیبات جدیدی از هسته و سیتوپلاسم را ممکن می سازد .
اولین تلاش موفقیت آمیز در امتزاج پروتوپلاست گل اطلسی توسط پاور و همکارانش ( Power . ۱۹۷۶ ) در انگلیس و نیز کارلسون و همکارانش ( Carlson . ۱۹۷۵ ) در آمریکا در تنباکو بود . بعد از جداسازی پروتوپلاست تنها مانع بین سیتوپلاسم و محیط خارجی غشاء پلاسما می باشد . فقدان دیواره سلولی باعث برقرار شدن تماس نزدیک غشاء پلاسمایی دو یا چند پروتوپلاست می شود که این امکان تحت شرایط طبیعی وجود ندارد وقتی غشاء پلاسمایی دو پروتوپلاست با هم تماس می یابند ، تحت بعضی شرایط آنها همانند دو حباب صابون به همدیگر خواهند چسبید . بعدا ً اگر محرک مناسبی بر روی آنها اعمال شود بار دیگر مثل دو حباب صابون با یکدیگر امتزاج یافته و به صورت یک گوی احاطه شده با یک غشاء درمی آیند . امروزه توجه زیادی برای امتزاج پروتوپلاست به عنوان یک وسیله بهنژادی گیاهان صورت می گیرد . اگرچه نتایج مثبت در این زمینه جهت تولید گیاهان زراعی اصلاح شده خیلی نادراست ولی اشخاص زیادی امتزاج پروتوپلاست را یک وسیله مفید برای اصلاح گران می دانند که آنها می توانند با استفاده ازاین روش گونه های ناسازگار جنسی را باهم تلاقی داده و صفات هسته ای و سیتوپلاسمی را منتقل نمایند . امتزاج پروتوپلاست را می توان برای تلاقی درون گونه ای ، درون جنسی و بین جنسی به کار برد . امتزاج پروتوپلاست ابزاری در جهت نیل به توارث فراجنسی ژنوم های اندامکی هر دو والد به شمار می رود . در فراورده های الحاقی که هسته ها ، پلاست ها و میتوکندری های هر دو والد در یک سلول حضور دارند ، اجتماع تازه ای از هسته یک گونه و اندامک های یک گونه دور پدید می آید . از طرفی نیز اثرات متقابل در سطح DNA بین ژنوم های اندامکی موجبات خلق ژنوم های مورد علاقه در اصلاح نباتات می شود . امتزاج پروتوپلاست و دوروگ گیری سوماتیکی در جنس ها و گونه هایی انجام می شود که تلاقی پذیری ندارد . این کار به منظور دست کاری گونه های گیاهی و در جهت افزایش تنوع ژنتیکی و ایجاد صفات و یا گیاهان جدید و تولید سیبریدها ( دورگ های سیتوپلاسمی ) استفاده می شود . با توجه به اینکه امتزاج پروتوپلاست برای آمیزش گونه هایی که نمی توان به صورت جنسی تلاقی یابند استفاده می شود ، لذا امتزاج پروتوپلاست را دورگ گیری شبه جنسی ( parasexual hybridization ) نیز نام گذاری کرده اند ، این فنون با رفع محدودیت تلاقی های بین گونه ای و بین جنسی از طریق کشت تخمک نارس یا بالغ ( Invitrro pollination ) و با بکارگیری فنون نجات ( یا کشت ) جنین ( embrio rescue ) به عنوان مکمل روش های اصلاح سنتی عمل نمایند . پومیتو ( Pomato ) تنها گیاه جدیدی است که از طریق امتزاج پروتوپلاست گوجه فرنگی و سیب زمینی تولید شده است ولی هنوز بهره برداری کشاورزی ندارد . امتزاج پروتوپلاست و تبادل سیتوپلاسم ها
در صورتیکه هدف ادغام هسته یک والد با سیتوپلاسم کامل والد دیگر است و درصورتیکه فراوانی دورگ های هسته ای بالا باشد می توان سیتوپلاسم بخشنده را به وسیله اشعه ایکس یا گاما در زمان قبل از امتزاج پرتو تابی کرد . این تیمارهیچ گونه اثر زیان آور بر روی ژنوم اندامک های نتایجی که پروتوپلاست آنها تابش دیده ندارد ، زیرا ژنوم ها تکرار زیادی دارند . برای اینکه صرفا ً اندامک های سیتوپلاسمی والدپرتو دیده نگهداری شود . مجیسی و همکاران ( ۱۹۸۰ ) برای حذف اندامک های والد دیگر ، استفاده از روش بازدارندگی متابولیکی که برای اولین بار در ژنتیک سلولی پستانداران مطرح شد پیشنهاد کردند ( Medgyesy ، ۱۹۸۰ ) . موادی مانند استات ید و استامیدید که بدین منظور و در این روش استفاده می شود ، پرتوتابی سیتوپلاسم والد بخشنده و عدم فعالیت متابولیکی هسته ای والد گیرنده را در هم ادغام می کند ( روش بخشنده - گیرنده ) و در حال حاضر به طور معمول استفاده می شود .
امتزاج پروتوپلاست و نوترکیبی ژنوم های پلاست
تفرق تصادفی تیپ های والدی در نسل های متوالی سلولی ، فراوانترین الگوی رفتاری توده مخلوط پلاست ها در یک فرآورده امتزاج به شمار می رود . اینگونه موارد در گزارش های متعدد هیبریدهای رویشی ( با هسته های هیبرید ) و هیبریدهای سیتوپلاسمی ( سایبریدها ) به تایید رسیده است . تحقیقات انجام شده حاکی از وقوع نوترکیب ژنوم پلاست در گیاهان عالی پس از دورگ گیری رویشی است ( بین N.plumbaginifolia و N.tabacum ) . در هر دو مورد ، از جهش یافته های پلاست که مشخصه آنها مقاومت به آنتی بیوتیک یا توکسین و آلبینیسم می باشد استفاده شده است . کمبود نوترکیبی پلاستی مانع انجام هرگونه تخمین دقیق از فراوانی این نوترکیبی ها در سلول های هتروپلاست حاصل از الحاق می شود . معلوم شده است کلید این موفقیت ها که استفاده از فشار گزینشی شدید بوده فقط زمانی امکان دارد که پلاست های جهش یافته به کار گرفته شوند . تجزیه و تحلیل مولکولی ژنوم های پلاست به دست آمده در نوترکیب های نیکوتیانا نشان داده است که از تعداد زیادی کراسینگ اور ناشی شده اند .
امتزاج پروتوپلاست و نو ترکیبی ژنوم های میتوکندریابی
نر عقیمی سیتوپلاسمی که در طیف وسیعی از گونه ها پیدا می شود تنها نشانگر ژنتیکی است که توسط ژنوم میتوکندری هدایت می شود . از این پدیده برای پیگیری سرنوشت ژنوم های میتوکندری در امتزاج پروتوپلاست استفاده می کنند . فقدان فشار گزینشی در سطح سلولی مانعی در سر راه بدست آوردن نوترکیبهای میتوکندریابی محسوب نمی شود . وقوع نوترکیبی معمولاً با یک فراوانی بالا رخ می دهد . مطالعات مولکولی قطعات محدود شده جدید میتوکندریابی در هیبریدهای رویشی یا سایبریدهای اطلسی و براسیکا تبادل DNA والدین را به خوبی به اثبات رسانده است . در نتیجه ژنوم میتوکندریابی با ترکیبی جدید نوترکیبی جدید و ترکیبی منحصر به فرد از توالی های والدی درهر سایبرید باززایی شده است . مطالعات امتزاج ، گیاهان نر عقیم سیتوپلاسمی را نیز شامل می شود . فنوتیپ سیتوپلاسمی در طول در طول مرحله گلدهی مشخص می گردد . در نیکوتیانا ، نرعقیمی ها بوسیله سیتوپلاسم گونه های مختلف القاء می شود . در این ترکیبات آلوپلاسمی ، پرچم ها به طور کلی حذف و یا اینکه به ساختارهای شبه ماده و یا گلبرگ مانند تغییر می یابند . هر سیتوپلاسمی را می توان از طریق ظاهر خاص گل شناسایی کرد . جنبه جالب توجه نوترکیبی میتوکندریابی حاصل از نیکوتیانای طبیعی و عقیم ، پیدایش ظواهری جدید در گلی است که با هر دو والد متفاوت است . این گونه نوترکیبات که در بین ژنوم های میتوکندریابی را در بین گونه ها نوید می دهد .
کاربرد امتزاج رویشی در دست ورزی گونه های زراعی
ژنوم های پلاستی که با یکدیگر در یک سلول منفرد ادغام می شوند . در مواقعی که یکی از والدین فاقد رقابت و یا از رقابت کمتری در مقایسه با دیگری برخوردار است این امر خیلی سریعتر به وقوع می پیوندد . بالعکس ، ژنوم های میتوکندریابی نوترکیب همراه با ژنوم پلاست یکی از والدین را دارا هستند .
انتقال سیتوپلاسم های نر عقیم به ارقام مختلف
امتزاج پروتوپلاست ابزاری برای انتقال تک مرحله ای یک سیتوپلاسم نر عقیم به واریته های مختلف بارور است . بدین ترتیب چرخه های متعدد تلاقی برگشتی مورد نیاز در روش های معمول تلاقی جنسی منتفی می گردد . در برنج گیاهان سایبرید حاوی هسته واریته بارور و میتوکندری های نوترکیب هر دو والد ، نر عقیمی والد نر عقیم را با خود حفظ کرده است .
این موفقیت بر اساس روش بخشنده - گیرنده صورت گرفته است ( Sidorov ، ۱۹۸۱ ) در هویج نیز بر مبنای همین روش ، نرعقیمی سیتوپلاسمی ( بساک قهوه ای ) به یک رقم بارور منتقل شده است . در براسیکا ، به ارقام مختلف منداب روغنی ، نر عقیمی سیتوپلاسمی انتقال یافته است . همچنین یک سیتوپلاسم سایبرید نرم عقیم اصلاح شده را که قبلاً از طریق دو رگ گیری رویشی به دست آمده بود به منداب روغنی زمستانه انتقال داده اند . در چغندرقند باززایی گیاه کامل از پروتوپلاست ها ، امکان انتقال سیتوپلاسم از منابع مختلف نر عقیم سیتوپلاسمی را به زمینه های مختلف هسته ای فراهم ساخته است . این روش در گونه مذکور از اهمیت خاصی برخوردار است زیرا چغندرقند دو ساله بوده و تولید هیبرید در جهان صرفاً بر مبنای نر عقیمی اون ( Owen CMS source ) (۱۹۴۵) است به طوری که این محصول به طور بالقوه در برابر نژادهای جدید پاتوژن ها آسیب پذیر می گردد . در توتون بر مبنای ادغام پروتوپلاست N.plumbaginifolia با N .tabacum ( حاوی پروتوپلاست پرتو دیده ) تیپ جدیدی از نر عقیمی سیتوپلاسمی خلق شده است . ترکیب مذکور به خصوص در موقعی که گونه دوم به عنوان والد مادری در نظر گرفته می شود به طور جنسی ناسازگار است .
اصلاح سیستم های نر عقیمی سیتوپلاسمی در چلیپاییان
دارند ، ( B.napus,... ) و روغن ( B.oleracea ,... ) محصولات کلمیان اهمیت اقتصادی مهمی از نظر سبزی برای مصارف انسانی و صنعتی پس از سویا و نخل سومین منبع مهم روغن به شمار می روند . با اینکه واریته های هیبرید در این گونه ها بر مبنای سیستم های خود ناسازگاری تولید شده اند . نر عقیمی سیتوپلاسمی پیدا شده در تربچه به براسیکا اولراسیا و براسیکا ناپوس از طریق تلاقی بین گونه ای منتقل گردید ولی گیاهان حاصله ضمن اینکه به طور کامل نر عقیم بودند به خاطر نقص کلروفیلی در دماهای پایین و ناهنجاری های گل ( تولید ناقص شهد و کاهش باروری ماده ) عملا ً قابل استفاده نبودند . در بررسی پلتیرو همکاران به منظور تبادل کلروپلاست های تربچه با کلروپلاست های براسیکاونیل به سنتز طبیعی کلروفیل ، امتزاج رویشی بین پروپلاست های براسیکای حاوی اندامک های تربچه و پروتوپلاست های دارای اندامک های براسیکا صورت گرفت و از بین گیاهان باززایی شده گیاهان سبز طبیعی و نر عقیم جدا شدند ( Pelletier ، ۱۹۸۳ ) آنها نشان دادند که حاوی ژنوم های نو ترکیب میتوکندریابی هستند . در بین این سایبریدها ، بعضی توسط متخصصین انتخاب شدند ، زیرا در آزمایش های مزرعه با نتاجشان ثابت کردند که سایر نقایص مربوط به مرفولوژی گل در آنها رفع شده است .
تولید شهد در این گیاه آنقدر کافی بود که همانند گیاه بارور زنبورها را جلب و تشکیل بذر طبیعی گشت . این ویژگی ها با وقایع نوترکیبی بین ژنوم های میتوکندریابی دو والد همبستگی داشت . بر اساس نتایج بدست آمده از سایبرید های براسیکا این نکته به اثبات رسید که از جنبه اصلاحی فقط بایستی بخش کوچکی از ژنوم بیگانه به درون گونه زراعی وارد گردد . زمانی که یک ژنوم صفت مطلوبی مانند نر عقیمی سیتوپلاسمی را با خود دارد و ژنوم کامل اندامک منتقل می گردد . به خاطر اثر متقابل بقیه ژن ها با هسته گونه زراعی ، معایب زراعی احتمال ظهورشان بالاست . این نتایج اهمیت عملی نوترکیبی میتوکندریابی که مجال حذف این صفات نامطلوب را فراهم می کند به اثبات می رساند . از این سیتوپلاسم ها در حال حاضر توسط متخصصین اصلاح نباتات استفاده میشود .
هیبریداسیون سلول سوماتیکی
هیبریداسیون سلول سوماتیکی که لقاح سلول سوماتیکی یا لقاح پروتوپلاست نامیده می شود دلالت بر اتحاد پروتوپلاست گیاهی سلول های سوماتیک گونه های مختلف و متعاقباً باززایی گیاهان هیبرید حاصل از پروتوپلاست های لقاح شده دارد . این روش برای استفاده در به نژادی گیاهی برای ایجاد هیبرید با اتحاد سلول های سوماتیک که در آن گیاه به طریقه دو رگ گیری جنسی تلاقی های بین گونه ای تهیه بذر امکان پذیر نباشد ، توصیه شده است . هیبریداسیون سلول سوماتیکی فرآیندی چند مرحله ای شامل ایزوله نمودن پروتوپلاست های گونه های مختلف ، امتزاج پروتوپلاست های دو گونه مختلف ، شناسایی نمودن پروتوپلاست های لقاح یافته هیبرید و باززایی گیاهان هیبرید دور از پروتوپلاست های لقاح شده می شود . قبل از اتحاد سلول های گیاهی ، حذف دیواره سلولی جهت تولید پروتوپلاست های بدون دیواره ضروری است . سلول های مزوفیل برگ یا سایر بافت های گیاهی ، کالوس یا کشت های سوسپانسون سلولی با آنزیم های هضم کننده دیواره سلولی برای بدست آوردن سوسپانسیون پروتوپلاست ها ، تیمار می گردند . برای دو رگ نمودن پروتوپلاست های خالص گونه ها آنها را مخلوط نموده و به همراه یک عامل آمیخته کننده غالباً پلی اتیلن گلایکول سانتریفوژ می نمایند . تا آنجا مخلوطی از پروتوپلاست های والدی ، پروتوپلاست های آمیخته شده هیبرید بوجود می آید . پروتوپلاست های هیبرید به سلول های دارای دیواره و ادامه تقسیم سلولس وادار شده و در نهایت گیاهچه های دارای ریشه و ساقه تولید می گردند . هیبریداسیون سلول سوماتیکی هنگامی به عنوان روشی برای اصلاح کننده نبات مورد استفاده می باشد که تکنیک های متداولی برای کشت پروتوپلاست گونه والدین ایجاد گردد .
باززایی گیاه از پروتوپلاست های بعضی از گونه ها مثل سیب زمینی ، توتون ، یونجه و تعداد اندکی از گونه های دیگر به راحتی امکان پذیر است در حالی که در غلات و حبوبات به سختی قابل اجرا می باشد . سلول های بین گونه های خویشاوند دور اغلب آنیوپلوئید بوده و به ندرت باززایی شده و در صورت باززایی شدن گیاهانی عقیم بدست می آید .
روش های القاء امتزاج :
امتزاج خود بخودی
همانطور که از اسم این روش مشخص است روشی است که در آن امتزاج پروتوپلاستی بدون دخالت دادن هر نوع ماده امتزاج دهنده یا استفاده از محرک صورت می گیرد . امتزاج خود بخودی برای اولین بارتوسط کاستر در سال ۱۹۰۲ تشریح شد . عیب عمده این روش این است که امتزاج به ندرت اتفاق می افتد . به کاربردن امتزاج خود بخودی تولید پروتوپلاست های چند هسته ای در سویا را که هسته های آنها به طور همزمان تقسیم می شوند امکان پذیر ساخته است . فراوانی اندک امتزاج با این روش مانع از توسعه آن گردیده و لذا تاکید بیشتر بر روش های آزمایشی امتزاج که ذیلاً تشریح می شود صورت می گیرد .
روش القاء امتزاج با پلی اتیلن گلیکول ( PEG )
روش استفاده از پلی اتیلن گلیکول به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج ، برای اولین بار توسط کائو در میکالوگ و والین و همکاران (۱۹۷۴) تشریح شده است .
PEG یک پلیمر آلی است که با وزن های مولکولی متفاوت قابل دسترس می باشد . موثرترین دامنه ۱۵۴۰ PEG ، ۴۰۰۰ PEG و ۶۰۰۰ PEG می باشد . برای القاء امتراج با PEG آن را به محیط کشت اضافه می نمایند و در این ماده مخلوط پروتوپلاست های قابل امتزاج را به حالت سوسپانسیون در می آورند . معمولا ً از PEG ۳۳- ۲۵ درصد ( حجمی / وزنی ) استفاده می شود . باید دقت کرد از مقدار درست و اندازه و اندازه مولکولی صحیح PEG استفاده کرد . افزودن مقدار زیادی از این ماده باعث انعقاد توده های پروتوپلاست می گردد و اضافه کردن مقدار خیلی کم آن موجب چسبیدن پروتوپلاست ها به جای امتزاج می شود . کار با PEG بایستی به دقت مورد ارزیابی قرار گیرد ، زیرا این ماده در سلول ها باعث مسمومیت می گردد . به طور معمول ، مخلوط پروتوپلاست را با PEG به مدت ۱۰ تا ۳۰ دقیقه در انکاباتور قرار می دهند . بعد از این مدت PEG را می شویند تا از مخلوط حذف گردد . اکثر امتزاج ها در مرحله شستشو قرار می گیرد .
بکار بردن PEG به عنوان یک ماده القاء کننده امتزاج امروزه بطور وسیع مورد استفاده قرار می گیرد .
روش استفاده از کلسیم و PH بالا
این روش شامل قرار دادن مخلوط پروتوپلاست در ۵./. مول کلروکلسیم با PH برابر ۵/۱۰ در ۴/. مول مانیتول درون انکوباتور می باشد ( Keller and Melchers ۱۹۷۳ ) پروتوپلاست ها را بعد از آن به مدت ۳ دقیقه در سرعت پایین سانتریفوژ ( g ×۵۰ ) در درون مخلوط قرار می دهند . کلروملچر موفقیت درامتزاج ۲۵ درصد پروتوپلاست ها را گزارش کرده اند . این روش برای امتزاج پروتوپلاست های مزوفیل برگ و پروتوپلاست های بدست آمده از سلول های کشت شده مورد استفاده قرار گرفت . پروتوپلاست های امتزاج یافته با مشاهدات چشمی قابل تشخیص هستند .
استفاده از نیتریت سدیم
اضافه کردن نیتریت سدیم ( No Na۵ ) به مخلوط پروتوپلاست ها به امتزاج آنها کمک می کند . استفاده از این روش توسط پارو و همکاران ( ۱۹۷۰ ) در موقع امتزاج درون گونه ای و بین گونه ای در پروتوپلاستهای یولاف و ذرت توسعه یافت . نیتریت سدیم امتزاج بین پروتوپلاست های با سیتوپلاسم زیاد ، پروتوپلاست های با واکوئل کم و پروتوپلاست های ریشه را القاء می کند . به طوری که هر چه پروتوپلاست ها متمایزتر باشند به همان میزان القاء امتزاج آسان تر خواهد شد .
روش های مصون سازی
هارتمن و همکاران ( ۱۹۷۳ ) روش مصون سازی القاء امتزاج پروتوپلاست را تشریح کردند . آنها پادتنی را با تزریق عصاره های گیاهی به بدن خرگوش تولید کردند . خرگوش دامنه وسیعی از آنتی بادی را بر ضد پروتئین های مختلف گیاهی تولید کرد . سپس اثر این پادتن را در امتزاج پروتوپلاست های به دست آمده از Bromus ، سویا و باقلا مورد مطالعه قرار دادند . این پادتن پس از امتزاج پروتوپلاست ها باعث آخته شدن گردید . پروتوپلاست های امتزاج یافته قوه نامیه خود را حفظ کرده و حتی تقسیمات سلولی هم در آنها مشاهده گردید .
امتزاج مکانیکی
میشل و اسچریک ( ۱۹۷۱ ) از روش های فیزیکی نظیر فشارهای مکانیکی القاء امتزاج پروتوپلاست استفاده می کردند . این روش ها به لحاظ راندمان کم آنها در تولید دورگ ها کمتر مورد توجه قرار گرفتند . ولی یکی از محاسن این روش این است که هیچ ماده شیمیایی که ممکن است عوارض جانبی داشته باشد ، مثل ایجاد موتاسیون در سلول های کشت شده ، در اینجا به کار نمی رود .
امتزاج الکتریکی
اگر پروتوپلاست را در یک محیط کشت سلولی حاوی الکترود قرار دهند و به آنها انرژی های پتانسیل مختلف وارد نمایند پروتوپلاست ها بین دو الکترود در یک خط قرار می گیرند . ( Zimmer , man ۱۹۸۲ ) . اگر شخص در این موقع شوک های الکتریکی با موج های مربعی کوتاه وارد نماید می تواند القاء پروتوپلاست را فراهم سازند . این روش به خاطر قابلیت کنترل بالای ذاتی از معروفیت زیادی برخوردار است . در حقیقت امتزاج دو پروتوپلاست با این روش امکان پذیر است .
روش های دیگر
کامیا ( Kameya ) استفاده از ژلاتین با غلظت ۲ تا ۵ درصد را به یک ماده امتزاج دهنده گزارش نموده است . او همچنین نشان داده است که ( PotassiumDextranSulphate ) ماده امتزاج دهنده خوبی است . از مواد شیمیایی دیگر که به عنوان مواد امتزاج دهنده با درجات مختلف استفاده شده است . کانکانوالین آ ( AConcanvalin ) پلی - ال - ارنیتین ، سیتوچلازین بی ، پلی - ال - لایزین ، گلیسرول و دی متیل سولفوکسید را می توان نام برد . ظاهراً روش های مختلف و زیادی برای القاء پروتوپلاست موجود است . در اکثریت این روش ها ، دو نوع پروتوپلاست با منشا مختلف در حضور ماده امتزاج دهنده با هم مخلوط می کنند و اجازه می دهند آنها به طور تصادفی با هم امتزاج یابند . مشکل این روش این است که پروتوپلاست نه تنها با سلول های هم نوع خود امتزاج می یابد بلکه با انواع دیگر هم می تواند ترکیب شود . روش هایی جهت شناسایی امتزاج های مطلوب که بطور طبیعی از امتزاج پروتوپلاست های نوع A با پروتوپلاست های نوع B حاصل می شود وجود دارد . در زیر به چند روش که برای غربالگری دورگ های سماتیکی استفاده شده است اشاره می کنیم .
الف - غربالگری مشاهده ای : از این روش برای غربالکری گیاهان حاصل از پروتوپلاست هایی که دارای صفات فیزیکی مشخصی هستند استفاده می شود . نتیجه این امتزاج تولید دورگی است که دارای واکوئل های حاوی کلروپلاست و آنتوسیانین با دو هسته می باشد . همچنین این روش می تواند برای امتزاج پروتوپلاست های بدست آمده از مزوفیل برگ و پروتوپلاست های سلول های کشت شده فاقد کلروفیل نیز مورد استفاده قرار گیرند . تکنیک ارزیابی مشاهده ای گاهی با روش کشت قطرات ریز ( Microdrop ) با هم به کار برده می شود . این قطرات ریز به طریق میکروسکوپی مورد آزمایش قرار گرفته است ، آن قطراتی که در آنها امتزاج انجام شده است نشان دار می کنند تا نمود بعدی آن را دنبال کنند . عیب عمده این روش آن است که خیلی پر زحمت بوده و تعداد محدودی از محصول امتزاج یافته را می توان غربالگری کرد .
ب - نشان های فلورسانس : استفاده از روش های رنگی فلورسنت برای اولین بار توسط کلر ( ۱۹۷۷ ) برای مطالعه امتزاج در سلول های گیاهی تشریح گردید . بعد ها از این روش برای امتزاج پروتوپلاست گیاهی جدا شده قابل استفاده شد . این روش بر این پایه برنامه ریزی شده است که اگر از دو پروتوپلاست اصلی کشت شده یکی را در sceininofluorece Octadecony و دیگری را در Palamine B Octadecy به مدت ۱۲ تا ۱۵ ساعت درون انکوباتور قرار دهند ، هر گروه از این پروتوپلاست ها توسط یک رنگ ویژه فلورسانس رنگ آمیزی خواهند شد . این مواد رنگی برای پروتوپلاست ها ایجاد مسمومیت نکرده و صدمه ای به قوه نامیه ، بازآفرینی دیواره و رشدشان وارد نمی سازند . پس از ایجاد امتزاج و تولید محصول امتزاج یافته ، شناسایی این دو رگ ها با مشخصات فلورسانس مربوطه زیر میکروسکوپ فلورسانس امکان پذیر خواهد بود و با استفاده از یک میکرومانیپولار هنوز یک روش وقت گیر بوده و نیاز به مهارت دارد .
ج - استفاده از دستگاه غربالگر سلولی فعال شده با فلورسانس : پروتوپلاست را با فلورسانس نشان دار می کنند که در بخش ( ب ) بیان گردید . پس از امتزاج سه نوع فلورسانس می توان مشاهده کرد : دو نوع از آنها فلورسانس های اصلی از جمعیت والدین می باشند و نوع سوم فلورسانس دورگ های حاصل از امتزاج است . این روش هنوز در مرحله آزمایشی است ولی با این روش می توان هزاران محصول امتزاج را جدا نمود . عیب عمده این تکنیک ظاهر فریبی و هزینه آن می باشد .
چ - غربالگری با توجه به مواد غذایی : در حالت های ویژه ، کارلسون و همکاران توانستند محصول دو رگ ( امتزاج یافته ) را با امکان کشت آنها در روی ماده غذایی که در آن امکان رشد برای لاین های والدین پروتوپلاست وجود ندارد جدا نمایند . کارلسون توانست پروتوپلاست های والدین و محصول امتزاج یافته را در محیط کشت فاقد اکسین کشت نماید . در این محیط دو لاین سلولی مربوط به والدین به خاطر فقدان اکسین در محیط کشت نتوانستند رشد کنند . ولی سلول های دو رگ تولید کننده اکسین توانستند رشد کرده و به کالوس تبدیل شوند . کارلسون توانست این گیاهان دورگه سوماتیکی را با گیاهان تولید شده با تلاقی جنسی متداول مقایسه نماید .
ح - حساسیت به نور : ملچرولبیب ( ۱۹۷۴ ) یک روش برای غربالگری دو رگ ها بر اساس مکمل ژنتیکی تشریح نمودند . آنها دو موتانت توتون را یکی با کلروفیل ناقص و دیگری حساس به نور را از توتون ( Tobacum N ) در آزمایش های خود بدست آوردند . وقتی پروتوپلاست های این دو گیاه را با هم امتزاج دادند ، نتیجه دستیابی به یک گیاه سبز نرمال بود . به این جهت در موقع بازآفرینی گیاهچه از مخروط پروتوپلاست دو کلون والدین به نور حساس بودند . ولی گیاهچه دو رگ یک گیاه سبز نرمال بود . این یک روش دقیق برای غربالگری دورگ های سوماتیکی است .
نیاز برای تولید تعداد بیشماری موتاسیون های قابل غربالگری یعنی گیاهچه حساس به نور و دارای کلروفیل ناقص برای این نوع مطالعات زیاد است .
د - حساسیت به دارو و مقاومت : پاور و همکاران ( ۱۹۷۶ ) از حساسیت گیاهان بر اکتینومایسین دی برای غربالگری محصولات امتزاج حاصل از اطلسی nia hybrida , P.parodii استفاده کردند . دو گیاه والدینی به اکتینومایسین - دی حساس ولی گیاه دو رگ مقاوم به آن می باشد . پاور توانست دو رگ های سوماتیکی را در حضور اکتینومایسین - دی در ماده غذایی بازآفرینی نماید . بعضی از محققین حالا به دنبال تولید موتانت های بسیار مقاوم هستند تا در مطالعات امتزاج پروتوپلاست از آنها استفاده شود .
چه گیاهانی را باید دورگ گیری کرد ؟
در اوایل سال ۱۹۶۰ بیولوژیست های گیاهی می خواستند بین علم و افسانه علمی تلاقی انجام دهند و امتزاج پروتوپلاست تا حدودی مطرح شد که بیشتر خیالی بود .
به عنوان مثال می خواستند بین هویج و کلم پیچ دورگ گیری انجام دهند به طوری که در قسمت هوایی تولید کلم و در زیر خاک ریشه هویج بدست آورند . نظیر آرزوی بشر در تولید پومیتو ( Pomato ) ( در قسمت هوایی گوجه فرنگی و در قسمت زیرین سیب زمینی ) دورگ گیری به عنوان یک سیستم مدل برای مطالعه گوجه فرنگی و سیب زمینی موفق بود گرچه این روش دورگ های سوماتیکی را تولید کرده و برای مطالعات پایه مفید است ولی تا بحال گیاه زراعی با ارزش از این روش به دست نیامده است . اخیراً امتزاج پروتوپلاست سیب زمینی های دارای ناسازگار جنسی S.brevidens . S.tuberosum انجام شده است . دورگ های ایجاد شده با روش امتزاج سماتیکی بارور بود و حاوی ژن های مهم مقاومت والد S.brevidens مثلاً مقاومت به ویروس پیچیدگی برگ ( PLRV ) می باشد . این روش با اینکه قابل استفاده است ولی از آن نمی توان مستقیماً برای تولید گیاهان زراعی مفید بهره برداری کرد اما یک وسیله خوب برای وارد کردن ژن ها به داخل برنامه های به نژادی سنتی است .
تشکیل سایبرید ( Cybrid )
وقتی دو پروتوپلاست با هم امتزاج می یابند حالات مختلفی ممکن است حاصل شود اگر دو هسته با هم امتزاج یابند یک دو رگ حقیقی تشکیل می شود . ولی اغلب دو هسته به طور مستقل از هم در سیتوپلاسم مخلوط به دست می آیند و تشکیل هتروکاریون را می دهند . تلفات کروموزومی می تواند در یک یا هر دو هسته ایجاد شود . اگر تمام هسته یکی از والدین از بین برود تنها یک هسته در مخلوط دو سیتوپلاسم باقی می ماند که این دو رگ را سیتوپلاست یا سایبرید می گویند . سایبریدها را همچنین می توان با امتزاج یک پروتوپلاست طبیعی ( نرمال ) با یک پروتوپلاست بدون هسته ( enucleated ) تولید کرد . پروتوپلاست بدون هسته رابا پرتو تابی یا حذف فیزیکی هسته می توان به دست آورد . در تولید طبیعی دورگ از راه تکثیر جنسی دوگامت با هم امتزاج یافته و تولید جنین زیگوت می نمایند . در این فرآیند سیتوپلاسم والد به طور طبیعی خارج شده و تنها صفات سیتوپلاسمی والد مادری باقی می ماند . بنابراین تولید سایبرید یک روش مفید برای انتقال اطلاعات توارثی سیتوپلاسمی می باشد . در حال حاضر محققین در مورد استفاده از سایبریدها برای انتقال قدرت مقاومت در برابر بعضی علف کش ها مطالعه می کنند . این صفت مقاومت در روی ژنوم کلروپلاست حمل می شود . انتقال نر عقیمی سیتوپلاسمی می تواند با انتقال ژن میتوکندری کنترل شود . مطالعه در روی سایبریدها همچنین برای تحقیق در امکان نوترکیبی در ژنوم های برون کروموزومی از اهمیت زیادی برخوردار است .
چشم اندازهای تکنولوژی پروتوپلاست
پیشرفت های قابل توجهی در دو دهه اخیر در تکنولوژی پروتوپلاست ( جدا کردن ، امتزاج ، کشت و باززایی گیاه )
در محصولات مهم زراعی از جمله غلات پدیدار شده است . امتزاج رویشی از طریق تولید هیبریدهای هسته ای نا متقارن بین گونه های دور مجال فائق آمدن بر موانع تبادلات در تکثیر جنسی را فراهم کرده است . در مواردی که پلی پلوئیدی و یا فقدان اندام های جنسی بارور ( محصولاتی که از طریق رویشی تکثیر می شوند ) مانعی بر سر راه تبادلات ژنی است این تکنیک امکانات زیادی را در اختیار قرار می دهد . بعلاوه امتزاج پروتوپلاست ابزار غیرقابل جایگزینی است که موجبات دست ورزی ژنوم اندامک ها را فراهم می کند و خلق ترکیبات جدیدی از هسته و سیتوپلاسم را ممکن می سازد .
دیدگاه ها