کشت سلول‌‌ها و بافت‌های گیاهی

کشت سلول‌‌ها و بافت‌های گیاهی
شیما میررحیمی ، کارشناس ارشد حشره شناسی،سازمان جهاد کشاورزی استان قزوین
مقدمه :
کشف پدیده توتی پوتنسی (Totipotency) یا توانایی یک سلول در ایجاد یک موجود کامل باعث شد تا در اواخر دهه 1960 میلادی روش‌های کشت سلول، بافت‌‌ها و اندام‌‌های گیاهی توسعه یابند. این روش‌ها به نام کشت بافت موسوم می‌‌باشند. فنون کشت سلول و بافت در اواخر دهه 70 توسعه یافتند و تکثیر گیاهان با روش مذکور از اوایل دهه 80 میلادی رایج شد. همچنین توسعه روش‌های انتقال ژن و مهندسی ژنتیک و ایجاد گیاهان و جانوران تراریخته بدون فنون کشت سلول و بافت امکان‌پذیر نبود. شناخت سریع کاربردهای وسیع فنون کشت بافت توسط متخصصین موجب گردید تا این فنون به‌سرعت گسترش یابند. به طوری که شاید امروزه از فعالیت‌‌های ساده و معمول مبارزه ژنتیکی به‌خصوص برای به‌نژادی گیاهان به‌شمار می‌‌آیند.
بسیاری از کاربردهای کشت بافت گیاهی در زمینه اصلاح و بهبود گیاهان کشاورزی از اواخر دهه 1980 میلادی در سطح وسیع جنبه کاربردی پیدا نموده‌‌اند. برزیل به کمک فنون کشت بافت توانسته است رقم‌‌هایی از نیشکر بدست آورد که عملکرد بیشتری دارند و به علف‌‌کش نیز مقاوم هستند. کشور مکزیک در زمینه کشت بافت برای تولید میوه‌‌جات و گل‌های زینتی برای صادرات فعالیت می‌‌کند. هلند سالانه مقادیر بسیار زیادی بذر سیب‌‌زمینی عاری از ویروس و انواع گل‌‌های زینتی را که از طریق ریزازدیادی تکثیر شده‌‌اند به کشورهای دیگر صادر می‌‌کند. رقم گندم زیائویان6 (Xiaoyan6) در چین از تلاقی T. aestivum x Agropyron elongatum و بکارگیری فن نجات جنین تولید شده است که 38 میلیون هکتار سطح زیرکشت دارد و افزایش عملکرد ناشی از آن حدود 16 میلیون تن (420 کیلوگرم در هکتار) بوده است.
یک شرکت چند ملیتی با استفاده از روش‌‌های کشت بافت و سلول، سالیانه بیش از یک میلیون اصله نهال نخل روغنی تولید و تکثیر می‌نماید و به کشورهای جهان سوم صادر می‌‌کند. سرعت عمل، خالص بودن و سالم بودن باعث می‌‌شود محصول (در مقایسه با کشت و تکثیر معمولی نخل) حدود 30 درصد افزایش یابد. در کره از طریق کشت بافت سیب‌زمینی طی سال‌های 1981 تا 1986 میزان محصول از 12 به 26 تن در هکتار رسیده است.
برخی از کشورها از کشت بافت و روش Cryopreservation (نگهداری بافت‌‌های زنده گیاهی در شرایط سرمای زیاد) برای استفاده در بانک ژن نگهداری طولانی مدت جهت حفظ ذخایر ژنتیکی گیاهانی که از طریق غیرجنسی تکثیر می‌‌شوند و یا نگهداری بذور آن‌ها به روش‌‌های معمول در بانک ژن مشکل و پرهزینه می‌‌باشد، استفاده نموده‌اند.
برخی کاربردهای کشت بافت گیاهی
در ادامه، برخی از مهمترین کاربردهای کشت بافت گیاهی و فواید اقتصادی آن‌ها مورد بررسی قرار می‌گیرد:
1- تولید گیاهان دابل‌‌هاپلوئید
لاین‌‌های دابل‌‌هاپلوئید (Double haploids) از طریق کشت اندام‌‌های هاپلوئید (دانه گرده، بساک، پرچم و غیره) و یا توسط تلاقی‌‌های بین‌گونه‌‌ای و بین‌جنسی (روش حذف کروموزومی) تولید می‌شوند.
این روش، طول دوره به‌نژادی را از حدود 12-10 سال (در برنامه‌‌های به‌نژادی سنتی و کلاسیک) به 7-6 سال کاهش می‌دهد و لاین‌‌های صددرصد خالص (هموزیگوس) ایجاد می‌نماید. بنابراین روش دابل‌هاپلوئیدی می‌‌تواند سریع‌تر از روش‌های سنتی، رقم جدید را معرفی نماید.
تولید رقم‌‌های دابل‌‌هاپلوئید در گندم، جو، برنج، کلزا، ذرت، نیشکر، سویا، انگور و سیب گزارش شده است. در چین رقم‌‌های جدید برنج دابل‌‌هاپلوئید حاصل از کشت دانه گرده و بساک در سطح میلیون‌‌ها هکتار کشت می‌‌شوند. در فرانسه نیز دو رقم کلزا که به طور غالب کشت¬وکار می‌‌شوند و یک رقم گندم و همچنین در کانادا دو رقم جو از این طریق تولید شده‌اند.
در ایران نیز چندین لاین امیدبخش گندم دابل‌هاپلوئید از طریق روش حذف کروموزومی (تلاقی گندم x ذرت) تولید شده است که احتمال می‌‌رود در سال‌های آینده به عنوان رقم جدید معرفی شوند.
2- ریزازدیادی و تکثیر انبوه گیاهان
ریزازدیادی (Micropropagation) و تکثیر سریع و انبوه ژنوتیپ‌‌های مطلوب و تولید گیاهان یکسان (Clone propagation) عاری از بیماری (به‌خصوص عاری از ویروس‌‌ها) از طریق کشت بافت و اندام‌های مختلف گیاهی در بسیاری از گیاهان مهم اقتصادی امکان‌پذیر می‌باشد. به‌عنوان مثال می‌توان به تولید سریع و انبوه سیب‌زمینی، خرما، موز، نخل روغنی، توت‌فرنگی، سیب، مارچوبه و نیشکر از گیاهان زراعی و باغی؛ اوکالیپتوس و سپیدار، از درختان جنگلی و رز، ارکیده، میخک، داودی، شمعدانی، ژربرا، دیفن‌باخیا، دراسنا، بنفشه آفریقایی، آنتوریوم، کوکب، انجیرزینتی (فیکوس)، فیلودندرون و سینگونیوم از گل‌ها و گیاهان زینتی اشاره نمود. این روش علاوه بر تکثیر سریع و تولید گیاهان عاری از عوامل بیماریزا، در اکثر گیاهان چندساله از جمله خرما و گردو باعث کاهش دوره نونهالی و زودباردهی آن‌ها می‌شود. همچنین فضای بسیار کمتری برای تکثیر نیاز می‌باشد. پیرتروم حشره‌کشی طبیعی است که از گل‌های خشک نوعی از گیاه داودی (Charanthemum cineraiaepolium) به دست می‌آید. کشور کنیا بزرگترین تولیدکننده آن‌ می‌باشد که تجارت سالانه آن از طریق ریزتکثیری حدود 75 میلیون دلار می‌باشد.
طی یک دوره هشت¬ماهه، از یک غده سیب‌زمینی عاری از ویروس حاصل از کشت مریستم انتهایی، تعداد 2 میلیارد غده سالم یکسان در یک مساحت 40 هکتاری بدست آمد. این سرعت تکثیر 100 هزار برابر بیشتر از سرعت تولید مثل جنسی است.
یک نخل روغنی توسط کشت یک قطعه از بافت برگ توانست طی یکسال حدود 500 هزار گیاه یکسان مقاوم به فیلاریوسیس با تولید روغن 6 تن در هکتار را تامین کند (این مقدار روغن 30-6 برابر بیشتر از سایر گیاهان اصلی تولید کننده روغن مانند آفتابگردان و سویا می‌باشد). همین روش برای تکثیر رقم‌های جدید نارگیل نیز به کار می‌رود. کشت مریستم انتهایی و یا جوانه‌های جانبی و تولید و تکثیر گیاهان عاری از بیماری و ویروس در بیش از 50 نوع گیاه شامل سیب‌زمینی، توت فرنگی، انگور، لیمو، کاساوا، سیب‌زمینی شیرین، موز و غیره امکان‌پذیر می‌باشد.
3- تنوع سوماکلونال
القای تنوع رویشی یا سوماتیکی (Soamaclonal variation) با هدف ایجاد تنوع جدید و یا انتخاب تنوع موجود و گزینش ژنوتیپ‌های مطلوب (مقاومت به تنش‌‌های زنده و غیرزنده، کیفیت بهتر و غیره) در درون محیط‌کشت (Invitro selection) انجام می‌شود.
کشت سلول‌ها و بافت‌های گیاهی در محیط‌کشت مصنوعی و در شرایط خاص باعث بروز تغییرات ژنتیکی در آن‌ها می‌شود. بنابراین جهت ایجاد تنوع و انتخاب گیاهان واجد صفات تغییریافته و جدید از قبیل گیاهان مقاوم به شوری، خشکی، گرما، سرما و مقاومت به آفات و بیماری‌ها و یا بهبود کیفیت مواد غذایی از این روش‌ها استفاده گردیده است که در بعضی از زمینه‌ها، رقم‌های تجاری نیز تولید شده است. طی دهه اخیر نیز این گونه پژوهش‌ها با شدت بیشتر دنبال می‌شود. با توجه به وجود اکثر مشکلات فوق در کشور، بکارگیری این فنون در ایران نیز می‌تواند پتانسیل اقتصادی قابل توجهی به دنبال داشته باشد.
از ایجاد رقم‌های جدید تجاری توسط تنوع سوماکلونال می‌توان به موارد زیر اشاره نمود:
- گوجه‌فرنگی دارای رنگ، طعم و بافت عالی که می‌تواند 14-10 روز پس از برداشت (بدون آسیب) نگهداری شود.
- فلفل شیرین با اندازه ریز، بدون دانه، تغییر درجه شیرینی و رنگ قرمز تیره از طریق کشت بساک به مرحله تجاری رسیده است.
- رقم‌های هویج و کرفس تردتر و شیرین‌تر به بازار عرضه شده است.
- یک رقم برنج دیررس و یک رقم پاکوتاه در ژاپن بدست آمده است.
- لاین‌های متحمل به شوری در برنج ایجاد شده است.
- تولید رقم‌های تجاری دارای صفات مطلوب در سیب‌زمینی، نیشکر، برنج، ذرت، جو، گندم، تنباکو، شبدر، یونجه، کلزا، یولاف و گوجه‌فرنگی نیز از این روش گزارش شده است.
4- دورگ‌گیری سوماتیکی و امتزاج پروتوپلاست
دورگ‌‌گیری سوماتیکی (Somatic hybridization) و امتزاج پروتوپلاست (Protoplast Fusion) در جنس‌ها و گونه‌هایی انجام می‌شود که تلاقی‌پذیری ندارند. این کار به منظور دستکاری گونه‌‌های گیاهی و در جهت افزایش تنوع ژنتیک و ایجاد صفات و یا گیاهان جدید و تولید سیبریدها (دورگ‌‌های سیتوپلاسمی) استفاده می‌شود. این فنون با رفع محدویت تلاقی‌‌های بین‌گونه‌‌ای و بین‌جنسی از طریق کشت تخمک نارس یا بالغ، گرده‌افشانی در محیط مصنوعی (Invitro Pollination) و یا بکارگیری فنون نجات (یا کشت) جنین (Embryo rescue) می‌توانند به عنوان مکمل روش‌‌های اصلاح سنتی عمل نمایند.
اگرچه به‌نژادگران امیدواری زیادی به این فنون دارند، ولی تاکنون موفقیت کاربردی چندانی نداشته است. از جمله صفاتی که در این روش برای انتقال مورد توجه هستند، می‌توان تحمل به تنش‌های محیطی از قبیل سرما، شوری، خشکی و مقاومت به آفات و بیماری‌ها را نام برد.
ایجاد دورگ‌های سوماتیکی به روش امتزاج پروتوپلاست در بیش از 30 گونه و 12 جنس انجام شده است. پومیتو (Pomato) تنها گیاه جدیدی است که از طریق امتزاج پروتوپلاست گوجه‌فرنگی و سیب‌زمینی تولید شده است ولی هنوز بهره‌برداری کشاورزی ندارد.
5- تولید متابولیت‌‌های ثانویه (Secondary metabolites)
گیاهان در طول زندگی خود برخی از مواد آلی شیمیایی پیچیده تولید می‌‌کنند که در رشد و نمو و فعالیت‌‌های حیاتی گیاه نقشی ندارند و به آن‌ها متابولیت‌‌های ثانویه گفته می‌‌شود. مواد معطر، مواد موثره دارویی، فرمون‌‌ها، حشره‌‌کش‌‌ها‌، علف‌‌کش‌‌ها، قارچ‌‌کش‌‌ها‌، هورمون‌‌های گیاهی و مواد آللوپاتیک (ایجاد کننده انواع مقاومت‌‌ها و یا بازدارنده رشد و نمو) از این جمله هستند. تولید انبوه و سریع این مواد پیچیده در مقیاس زیاد از روش‌‌های شیمیایی آزمایشگاهی، مشکل و یا غیرممکن می‌‌باشد. از سوی دیگر، به دلیل گسترش مصرف مواد دارویی و صنعتی، نیاز به مواد جدید با تاثیرات بیشتر از منابع متنوع تجدیدشونده شیمیایی با عوارض زیست محیطی کمتر و روش‌‌های استخراج آسان و اقتصادی ضروری می‌‌باشد. مبارزه ژنتیکی و از جمله کشت بافت‌‌های گیاهی برای تولید آسان و انبوه متابولیت‌‌های ثانویه، یک راه‌حل مناسب و ارزان‌‌تر برای این مشکل می‌‌باشد.
قیمت متابولیت‌‌های ثانویه نیز بسیار گران می‌‌باشد، به طوری که فروش محصولات دارویی مانند شیکونین (Shikonin) یا دیجی‌‌توکسین (Digitoxin) و یا عطرهایی همچون روغن جاسمین (Jasmin) از چند دلار تا چند هزار دلار به ازای هر کیلو تغییر می‌‌کند. به عنوان مثال قیمت هر کیلو از داروهای ضد سرطان مانند وین‌بلاستین (Vinblastin)، وین‌کریستین (Vincristin) و تاگزول (Taxol) به چند هزار دلار می‌‌رسد.